Tofauti Muhimu – Kaskazini dhidi ya Kusini dhidi ya Ukaushaji wa Magharibi
Ugunduzi wa mfuatano mahususi wa DNA, RNA na protini ni muhimu kwa aina mbalimbali za tafiti katika baiolojia ya Molekuli. Gel electrophoresis ni mbinu ambayo hutenganisha DNA, RNA, na protini kulingana na ukubwa wao. Kutoka kwa wasifu wa jeli, mfuatano mahususi wa DNA, mfuatano wa RNA, au protini hugunduliwa kwa mbinu maalum zinazoitwa blotting na mseto kwa probe zilizo na lebo. Kuna aina tatu tofauti za ukaushaji, yaani, kusini, kaskazini na magharibi. Tofauti kuu kati ya ukaushaji wa kaskazini wa kusini na magharibi unatokana na aina ya molekuli inayotambua kutoka kwa sampuli. Ukaushaji wa Kusini ni njia inayotambua mfuatano mahususi wa DNA kutoka kwa sampuli ya DNA. Ukaushaji wa Kaskazini ni mbinu ambayo hutambua mfuatano mahususi wa RNA kutoka kwa sampuli ya RNA. Ukaushaji wa Magharibi ni mbinu ambayo hutambua protini mahususi kutoka kwa sampuli ya protini.
Je, Southern Blotting ni nini?
Mbinu ya ukaushaji wa Kusini ilitengenezwa na E. M. Southern mwaka wa 1975 kwa ajili ya kutambua mfuatano mahususi wa DNA kutoka kwa sampuli ya DNA. Hii ni mbinu ya kwanza ya kufuta iliyoletwa katika biolojia ya molekuli. Iliwezesha ugunduzi wa jeni mahususi kutoka kwa DNA, vipande maalum kutoka kwa DNA, n.k. Kuna hatua kadhaa zinazohusika katika mbinu ya ufutaji wa kusini. Ni kama ifuatavyo.
- DNA imetengwa kutoka kwa sampuli na kuyeyushwa kwa vikwazo vya endonuclease.
- Sampuli iliyosagwa hutenganishwa na Agarose gel electrophoresis.
- Vipande vya DNA katika jeli hubadilishwa kuwa nyuzi moja kwa kutumia myeyusho wa alkali.
- DNA iliyokwama moja huhamishiwa kwenye membrane ya chujio cha nitrocellulose kwa kuhamisha kapilari.
- DNA iliyohamishwa imewekwa kwenye utando kabisa.
- DNA isiyobadilika kwenye utando imechanganywa kwa vichunguzi vilivyo na lebo.
- DNA isiyofungwa huoshwa na kutoka kwenye utando kwa kunawa.
- filamu ya eksirei huwekwa wazi kwenye utando na kiotografia hutayarishwa.
Ukaushaji wa Kusini unatumika kwa vipengele tofauti vya baiolojia ya molekuli. Ni muhimu katika uchoraji wa ramani ya RFLP, tafiti za kitaalamu, methylation ya DNA katika usemi wa jeni, ugunduzi wa jeni zilizobadilishwa katika matatizo ya kijeni, uwekaji alama za vidole kwenye DNA, n.k.
Kielelezo 01: Mbinu ya Kunyunyizia Kusini
Northern Blotting ni nini?
Ukaukaji wa Kaskazini ni mbinu iliyoundwa kutambua mfuatano mahususi wa RNA au mfuatano wa mRNA kutoka kwa sampuli ili kuchunguza usemi wa jeni. Mbinu hii ilitengenezwa na Alwine, Kemp, na Stark mwaka wa 1979. Inatofautiana na mbinu za kuzuia kusini na magharibi kutokana na hatua kadhaa. Hata hivyo, mbinu hii pia inafanywa kupitia gel electrophoresis, blotting, na mseto kwa uchunguzi maalum lebo na kutambua. Mbinu ya ufutaji wa sehemu ya kaskazini inatekelezwa kama ifuatavyo.
- RNA inatolewa kutoka kwa sampuli na kutenganishwa na gel electrophoresis.
- RNA huhamishwa kutoka kwa jeli hadi kwenye utando wa kukatika na kurekebishwa.
- Membrane inatibiwa kwa probe iliyo na lebo iliyotayarishwa kutoka kwa cDNA au RNA (uchunguzi unasaidiana na mfuatano maalum katika sampuli).
- Uchunguzi umewekewa utando ili kuufunga kwa mfuatano maalum.
- Vichunguzi ambavyo havijafungwa huwashwa.
- Vipande vilivyochanganywa vinatambuliwa na rekodi ya sauti.
Ukaukaji wa Kaskazini ni zana muhimu katika kutambua na kuhesabu idadi ya mRNA iliyochanganywa, kuchunguza uharibifu wa RNA, kutathmini nusu ya maisha ya RNA, kugundua kuungana kwa RNA, kuchunguza usemi wa jeni, n.k.
Kielelezo 02: Ufungaji wa Kaskazini
Western Blotting ni nini?
Ukaushaji wa Magharibi ni mbinu ya kugundua protini mahususi kutoka kwa mchanganyiko wa protini kwa kutumia kingamwili iliyoitwa. Kwa hivyo, doa ya magharibi pia inajulikana kama immunoblot. Mbinu hii ilianzishwa na Towbin et al mnamo 1979 na sasa inafanywa mara kwa mara katika maabara kwa uchambuzi wa protini. Hatua ni kama ifuatavyo.
- Protini hutolewa kutoka kwa sampuli
- Protini hutenganishwa kwa ukubwa wake kwa kutumia polyacrylamide gel electrophoresis
- Molekuli zilizotenganishwa huhamishiwa kwenye utando wa PVDF au utando wa nitrocellulose kwa electroporation
- Membrane imefungwa kwa ajili ya kuunganishwa kwa njia isiyo maalum na kingamwili
- Protini zinazohamishwa huunganishwa na kingamwili ya msingi (enzyme inayoitwa kingamwili).
- Membrane huoshwa ili kuondoa kingamwili za msingi ambazo hazifungamani mahususi
- Kingamwili zilizofungamana hugunduliwa kwa kuongeza kipande kidogo cha maji na kugundua unyesho wa rangi ulioundwa
Ukaushaji wa Magharibi ni muhimu katika ugunduzi wa kingamwili za kuzuia VVU katika sampuli ya seramu ya binadamu. Western blot pia inaweza kutumika kama kipimo cha kuthibitisha maambukizi ya Hepatitis B na kipimo cha uhakika cha ugonjwa wa ng'ombe wazimu.
Kielelezo 03: Western Blotting
Kuna tofauti gani kati ya Northern Southern na Western Blotting?
Northern vs Southern vs Western Blotting |
|
| Aina ya Molekuli Imegunduliwa | |
| Northern Blotting | Ufutaji wa Kaskazini hutambua mfuatano mahususi wa RNA kutoka kwa sampuli ya RNA. |
| Kulia kwa Kusini | Ufutaji wa Kusini hutambua mfuatano mahususi wa DNA kutoka kwa sampuli ya DNA. |
| Western Blotting | Ukaushaji wa Magharibi hutambua protini mahususi kutoka kwa sampuli ya protini. |
| Aina ya Gel | |
| Northern Blotting | Hii hutumia jeli ya Agarose/formaldehyde. |
| Kulia kwa Kusini | Hii hutumia jeli ya Agarose. |
| Western Blotting | Hii hutumia jeli ya Polyacrylamide. |
| Njia ya Kufuta | |
| Northern Blotting | Huu ni uhamisho wa kapilari. |
| Kulia kwa Kusini | Huu ni uhamisho wa kapilari. |
| Western Blotting | Hii ni uhamisho wa umeme. |
| Uchunguzi Umetumika | |
| Northern Blotting | cDNA au RNA huchunguza chenye lebo ya mionzi au isiyo na mionzi. |
| Kulia kwa Kusini | vichunguzi vya DNA vimewekwa lebo ya mionzi au isiyo ya mionzi. |
| Western Blotting | Kingamwili msingi hutumika kama uchunguzi. |
| Mfumo wa Ugunduzi | |
| Northern Blotting | Hii inafanywa kwa kutumia taudiografia, au utambuzi wa mwanga au mabadiliko ya rangi. |
| Kulia kwa Kusini | Hii inafanywa kwa kutumia taudiografia, utambuzi wa mwanga au mabadiliko ya rangi. |
| Western Blotting | Hii inafanywa kwa kutumia utambuzi wa mwanga au mabadiliko ya rangi. |
Muhtasari – Kaskazini dhidi ya Kusini dhidi ya Ufungashaji wa Magharibi
Blotting ni mbinu maalum iliyoundwa kwa ajili ya kutambua DNA, RNA au protini mahususi kutoka kwa sampuli. Kuna taratibu tatu tofauti za ukaushaji, yaani kaskazini, kusini na magharibi, kugundua aina maalum ya molekuli. Mbinu ya ukaushaji wa Kaskazini imeundwa kutambua mfuatano maalum wa RNA kutoka kwa mchanganyiko wa RNA. Mbinu ya ukaushaji wa kusini huwezesha ugunduzi wa mfuatano mahususi wa DNA kutoka kwa sampuli ya DNA na mbinu ya ukaushaji wa magharibi hutengenezwa ili kutambua protini mahususi kutoka kwa mchanganyiko wa protini.
