Tofauti Muhimu – Maxam Gilbert dhidi ya Mfuatano wa Sanger
Nucleotidi ni vitengo vya kimsingi vya miundo na vijenzi vya DNA. Molekuli ya DNA inaundwa na mnyororo wa polynucleotide. Kuna nukleotidi nne tofauti zinazopatikana kwenye DNA. Nucleotidi hizi zinajumuisha besi nne tofauti za nitrojeni zinazoitwa A (adenine), G (guanini), C (cytosine), T (thymine). Mpangilio wa nyukleotidi katika molekuli ya DNA una umuhimu mkubwa kwani husimba taarifa muhimu za kijeni kwa ukuaji na ukuaji wa viumbe. Mpangilio wa DNA unarejelea mchakato ambao huamua mfuatano sahihi wa nyukleotidi wa DNA. Kuna njia tofauti za mpangilio wa DNA. Mfuatano wa Maxam Gilbert na upangaji wa DNA ya Sanger ni mbinu mbili za mpangilio wa DNA ambazo ni za mfuatano wa kizazi cha kwanza. Utaratibu wa mpangilio wa Maxam Gilbert huamua mfuatano wa msingi kwa kung'oa kwa kemikali ncha ya 5' iliyo na lebo ya vipande vya DNA kwa upendeleo katika kila moja ya nyukleotidi nne na elektrophoresis ya gel. Utaratibu wa mpangilio wa Sanger huamua mfuatano wa nyukleotidi kwa kuunganisha DNA yenye ncha moja kwa kutumia DNA polymerase na dideoxynucleotides na gel electrophoresis. Hii ndio tofauti kuu kati ya Maxam Gilbert na Sanger Sequencing.
Maxam Gilbert Anafuata Nini?
Mfuatano wa Maxam Gilbert, pia unajulikana kama mbinu ya upangaji wa kemikali, ni mbinu ambayo ilitengenezwa ili kubainisha mpangilio wa nyukleotidi katika DNA. Njia hii ilianzishwa na W alter Gilbert na Alan Maxam mnamo 1976 na ikawa maarufu kwani inaweza kufanywa moja kwa moja na DNA iliyosafishwa. Njia ya Maxam Gilbert ni ya kizazi cha kwanza cha mpangilio wa DNA, na ilikuwa njia ya kwanza ya mpangilio iliyotumiwa sana na wanasayansi.
Kanuni ya msingi ya mbinu hii iko kwenye kizuizi cha vipande vya DNA vilivyo na lebo ya mwisho katika besi mahususi kwa kemikali na masharti mahususi ya msingi na kutenganishwa kwa vipande vilivyo na lebo kwa electrophoresis kama inavyoonyeshwa kwenye mchoro 01. Vipande hutenganishwa kulingana na takwimu za 01. kwa ukubwa wao kwenye gel. Kwa kuwa vipande vimewekwa lebo, mfuatano wa molekuli ya DNA unaweza kutambulika kwa urahisi.
Mbinu ya Maxam gilbert hutumia kemikali mahususi ya msingi kuvunja DNA katika besi mahususi. Kemikali mbili za kawaida zinazoitwa dimethyl sulphate na kemikali za hidrazini hutumiwa kushambulia kwa kuchagua purines na pyrimidines, mtawalia.
Mbinu ya upangaji ya Maxam Gilbert inatekelezwa kupitia hatua kadhaa kama ifuatavyo.
- Usafishaji wa mlolongo wa DNA kwa kutumia vizuizi vya endonuclease
- Kuweka lebo kwenye ncha za vipande vya DNA kwa kuongeza fosfeti za mionzi
- Usafishaji wa vipande vilivyo na lebo kutoka kwa vipande visivyo na lebo kwa kutumia gel electrophoresis
- Kutenganishwa kwa DNA yenye lebo ya mwisho katika mirija minne na kutibu kwa kemikali mahususi msingi kando
- Electrophoresis ya yaliyomo katika kila bomba kwenye mistari tofauti kwenye jeli na utenganishaji wa vipande kulingana na urefu wake.
- Ugunduzi wa vipande kwa otoradiograph.
Kielelezo 01: Maxam Gilbert Sequencing
Mfuatano wa Sanger ni nini?
Mfuatano wa Sanger ni mbinu ya mfuatano iliyotengenezwa na Frederick Sanger na wenzake mnamo 1977 ili kubainisha mfuatano wa msingi wa kipande fulani cha DNA. Pia inajulikana kama mfuatano wa kusitisha mnyororo au njia ya mpangilio wa Dideoxy. Mbinu hii hufanya kazi kwa kanuni ya ujumuishaji wa kuchagua wa mnyororo wa kukomesha dieoxynucleotides (ddNTPs) kama vile ddGTP, ddCTP, ddATP na ddTTP kwa DNA polymerase wakati wa usanisi wa DNA iliyokwama moja ili kukomesha uundaji wa uzi. Dideoxynucleotides hukosa vikundi vya 3’ OH kwa ajili ya kuunda vifungo vya phosphodiester na nyukleotidi iliyo karibu. Kwa hivyo, uundaji wa uzi hukoma mara ddNTP inapojumuishwa kwenye uzi mpya unaoundwa wakati wa mfuatano wa sanger.
Katika njia hii, athari nne tofauti za usanisi wa DNA (PCR) hutekelezwa katika mirija minne tofauti yenye aina moja ya ddNTP. Mahitaji mengine pia hutolewa kwa mirija ya PCR ikijumuisha vianzio, dNTPs, Taq polymerase, hali maalum, n.k. Athari nne tofauti hufanywa katika mirija minne yenye michanganyiko minne. Baada ya athari za PCR, vipande vya DNA vinavyotokana na joto hutenganishwa na electrophoresis ya gel. Kisha vipande vinaonyeshwa kwa kutumia kitangulizi kilichoandikwa (radioactive au fluorescent) au dNTP kama inavyoonyeshwa kwenye mchoro 02.
Kielelezo 02: Mfuatano wa Sanger
Kuna tofauti gani kati ya Maxam Gilbert na Sanger Sequencing?
Max Gilbert vs Sanger Sequencing |
|
| Mfuatano wa Maxam Gilbert ndiyo mbinu ya kwanza iliyoundwa kwa mpangilio wa DNA. | Mbinu ya mfuatano wa Sanger ilianzishwa baada ya mbinu ya mfuatano ya Maxam Gilbert. |
| Matumizi | |
| Njia hii haitumiki sana. | Mfuatano wa sanger hutumiwa mara kwa mara kwa upangaji. |
| Matumizi ya Kemikali Hatari | |
| Inatumia kemikali hatari. | Matumizi ya kemikali hatari ni machache ikilinganishwa na mbinu ya Maxam Gilbert. |
| Kuweka lebo kwa Utambuzi | |
| Njia hii hutumia mionzi P32 kwa kuweka lebo kwenye ncha za vipande vya DNA. | Mfuatano wa sanger hutumia ddNTP zenye mionzi au umeme. |
Muhtasari – Maxam Gilbert dhidi ya Mfuatano wa Sanger
Mfuatano wa Maxam Gilbert na Sanger ni aina mbili za mbinu za kupanga DNA zinazokuja chini ya mpangilio wa DNA wa kizazi cha kwanza. Mfuatano wa Maxam Gilbert ndio njia ya kwanza iliyoanzishwa kwa mpangilio wa DNA mnamo 1976, na inafanywa kwa kuvunja sehemu ya mwisho iliyoitwa vipande vya DNA na kemikali maalum za msingi. Kwa hivyo, inajulikana kama mpangilio wa kemikali. Mbinu ya mpangilio ya Sanger ilianzishwa mwaka wa 1977, na inategemea miitikio ya kukomesha mnyororo inayoendeshwa na ddNTP. Mbinu ya upangaji sanger maarufu kuliko mbinu ya Maxam Gilbert kutokana na hasara kadhaa za njia ya Maxam Gilbert kama vile matumizi ya muda kupita kiasi, matumizi ya kemikali hatari, n.k. Hii ndio tofauti kati ya Maxam Gilbert na Sanger mpangilio.
