Tofauti Muhimu – Mfuatano wa Sanger vs Pyrosequencing
Mfuatano wa DNA ni muhimu sana kwa uchanganuzi wa DNA kwa kuwa ujuzi wa mpangilio sahihi wa nyukleotidi kwenye eneo fulani la DNA hufichua taarifa nyingi muhimu kuihusu. Kuna njia tofauti za mpangilio wa DNA. Mfuatano wa Sanger na Pyrosequencing ni mbinu mbili tofauti za mpangilio wa DNA zinazotumiwa sana katika Biolojia ya Molekuli. Tofauti kuu kati ya mpangilio wa Sanger na Pyrosequencing ni kwamba mpangilio wa Sanger hutumia dieoxynucleotides kukomesha usanisi wa DNA ili kusoma mfuatano wa nyukleotidi huku pyrosequencing hutambua kutolewa kwa pyrofosfati kwa kujumuisha nyukleotidi na kuunganisha mpangilio unaosaidia wa mfuatano wa usomaji.
Mfuatano wa Sanger ni nini?
Mfuatano wa Sanger ni njia ya kizazi cha kwanza ya kupanga DNA iliyotengenezwa na Frederick Sanger na vyuo vyake mwaka wa 1977. Pia inajulikana kama Mfuatano wa Kumaliza Msururu au mpangilio wa Dideoxy kwa kuwa inategemea kusitishwa kwa mnyororo na dieoxynucleotides (ddNTPs). Njia hii ilitumika sana kwa zaidi ya miaka 30 hadi Upangaji wa Kizazi Kipya (NGS) ulipoanzishwa. Mbinu ya upangaji sanger iliwezesha ugunduzi wa mpangilio sahihi wa nyukleotidi au kiambatisho cha kipande fulani cha DNA. Inatokana na ujumuishaji wa kuchagua wa ddNTP na kukomesha usanisi wa DNA wakati wa uigaji wa DNA wa vitro. Kutokuwepo kwa vikundi vya 3’ OH ili kuendeleza uundaji wa dhamana ya phosphodiester kati ya nyukleotidi zilizo karibu ni kipengele cha kipekee cha ddNTPs. Kwa hivyo, mara tu ddNTP inapoambatishwa, urefu wa mnyororo hukoma na kuisha kutoka kwa hatua hiyo. Kuna ddNTP nne - ddATP, ddCTP, ddGTP na ddTTP - zinazotumika katika mpangilio wa Sanger. Nucleotidi hizi husimamisha mchakato wa urudufishaji wa DNA zinapoingizwa kwenye mkondo unaokua wa DNA na kusababisha urefu tofauti wa DNA fupi. Electrophoresis ya kapilari ya jeli hutumika kupanga nyuzi hizi fupi za DNA kwa ukubwa wake kwenye jeli kama inavyoonyeshwa kwenye Mchoro 01.
Kielelezo 1: Electrophoresis ya jeli ya kapilari ya DNA fupi iliyosanisishwa
Kwa uigaji wa DNA wa ndani, mahitaji machache yanapaswa kutolewa. Ni kimeng'enya cha DNA polymerase, DNA ya kiolezo, vianzio vya oligonucleotide, na deoxynucleotides (dNTPs). Katika mpangilio wa Sanger, uigaji wa DNA hufanywa katika mirija minne tofauti ya majaribio pamoja na aina nne za ddNTP kando. Deoxynucleotides hazibadilishwi kabisa na ddNTP husika. Mchanganyiko wa dNTP fulani (kwa mfano; dATP + ddATP) imejumuishwa kwenye bomba na kuigwa. Bidhaa nne za bomba tofauti zinaendeshwa kwenye gel katika visima vinne tofauti. Kisha kwa kusoma jeli, mlolongo unaweza kutengenezwa kama inavyoonyeshwa kwenye Mchoro 02.
Kielelezo 02: Mfuatano wa Sanger
Mfuatano wa sanger ni mbinu muhimu inayosaidia katika maeneo mengi ya baiolojia ya molekuli. Mradi wa jenomu za binadamu ulikamilika kwa ufanisi kwa usaidizi wa mbinu za upangaji za Sanger. Mfuatano wa Sanger pia ni muhimu katika mpangilio wa DNA lengwa, utafiti wa saratani na magonjwa ya kijeni, uchanganuzi wa usemi wa jeni, utambuzi wa binadamu, utambuzi wa pathojeni, mpangilio wa vijidudu n.k.
Kuna hasara kadhaa za mpangilio wa Sanger:
- Urefu wa DNA inayopangwa hauwezi kuwa zaidi ya jozi msingi 1000
- Kifungu kimoja pekee kinaweza kupangwa kwa wakati mmoja.
- Mchakato huo unatumia muda mwingi na ni wa gharama kubwa.
Kwa hivyo, mbinu mpya za hali ya juu za kupanga mpangilio zilitengenezwa kwa muda ili kutatua matatizo haya. Hata hivyo, mpangilio wa Sanger bado unatumika kutokana na matokeo yake sahihi zaidi hadi takriban vipande 850 vya urefu wa jozi msingi.
Pyrosequencing ni nini?
Pyrosequencing ni mbinu ya riwaya ya kupanga DNA kulingana na "mfuatano kwa usanisi". Mbinu hii inategemea ugunduzi wa kutolewa kwa pyrophosphate kwenye kuingizwa kwa nyukleotidi. Mchakato huo unatumiwa na vimeng'enya vinne tofauti: DNA polima, ATP sulfurylase, luciferase na apyrase na substrates mbili adenosine 5' phosphosulfate (APS) na luciferin.
Mchakato huanza na kitangulizi kinachofunga kwa kiolezo cha DNA chenye ncha moja na polima ya DNA huanza ujumuishaji wa nyukleotidi inayosaidiana nayo. Nukleotidi zinapoungana (upolimishaji wa asidi ya nukleiki), hutoa pyrofosfati (vikundi viwili vya fosfati vilivyounganishwa pamoja) vikundi na nishati. Kila nyongeza ya nyukleotidi hutoa kiasi sawa cha pyrofosfati. Pyrofosfati hubadilika kuwa ATP na ATP sulfurylase mbele ya substrate APS. ATP inayozalishwa husukuma ubadilishaji wa luciferase-iliyopatanishwa na luciferin hadi oxyluciferin, na kutoa mwanga unaoonekana kwa kiasi ambacho kinalingana na kiasi cha ATP. Mwanga hugunduliwa na kifaa cha kutambua photon au kwa photomultiplier na huunda pyrogram. Apyrase huharibu ATP na dNTP zisizojumuishwa katika mchanganyiko wa majibu. Nyongeza ya dNTP inafanywa mara moja kwa wakati mmoja. Kwa kuwa kuongeza ya nucleotide inajulikana kulingana na kuingizwa na kugundua mwanga, mlolongo wa template unaweza kuamua. Pirogramu hutumika kutengeneza mfuatano wa nyukleotidi wa sampuli ya DNA kama inavyoonyeshwa kwenye Mchoro 03.
Pyrosequencing ni muhimu sana katika uchanganuzi wa upolimishwaji wa nyukleotidi moja na mfuatano wa misururu mifupi ya DNA. Usahihi wa hali ya juu, kunyumbulika, urahisi wa uwekaji kiotomatiki na uchakataji sambamba ni faida za upangaji mfuatano juu ya mbinu za mpangilio za Sanger.
Kielelezo 03: Pyrosequencing
Kuna tofauti gani kati ya Sanger Sequencing na Pyrosequencing?
Mfuatano wa Sanger vs Pyrosequencing |
|
| Mfuatano wa Sanger ni mbinu ya kupanga DNA kulingana na ujumuishaji wa kuchagua wa ddNTPs kwa DNA polymerase na kusitishwa kwa mnyororo. | Pyrosequencing ni mbinu ya kupanga DNA kulingana na ugunduzi wa kutolewa kwa pyrofosfati baada ya kuingizwa kwa nyukleotidi. |
| Matumizi ya ddNTP | |
| ddNTPs hutumika kusitisha urudufishaji wa DNA | ddNTP hazitumiki. |
| Enzymes zinahusika | |
| DNA polymerase zimetumika. | Enzymes nne hutumika: DNA polymerase, ATP sulfurylase, Luciferase na Apyrase. |
| Njia ndogo Zilizotumika | |
| APS na Luciferin hazitumiki. | Adenosine 5’ phosphosulfate (APS) na luciferin hutumika. |
| Kiwango cha Joto | |
| Huu ni mchakato wa polepole. | Huu ni mchakato wa haraka. |
Muhtasari – Sanger Sequencing vs Pyrosequencing
Mfuatano wa Sanger na Pyrosequencing ni mbinu mbili za kupanga DNA zinazotumika katika baiolojia ya molekuli. Mpangilio wa Sanger huunda mpangilio wa nyukleotidi kwa mfuatano kwa kusitisha urefu wa mnyororo wakati pyrosequencing huunda mpangilio sahihi wa nyukleotidi kwa mlolongo kwa kujumuisha nyukleotidi na kugundua kutolewa kwa pyrofosfati. Kwa hivyo, tofauti kuu kati ya mpangilio wa Sanger na Pyrosequencing ni kwamba mpangilio wa Sanger hufanya kazi katika upangaji kwa kusitishwa kwa mnyororo huku pyrosequencing inafanya kazi katika upangaji kwa usanisi.
