Tofauti Muhimu – Vifunguo vya PCR dhidi ya Vipimo vya Kuratibu
Kwa maendeleo ya hivi majuzi katika uwanja wa baiolojia ya molekuli, mbinu tofauti za kijeni zilitengenezwa ambazo zilifanya michakato ya uchunguzi wa njia tofauti za somo kuwa rahisi na sahihi. PCR na taratibu zingine za mpangilio ni mbinu mbili muhimu kama hizo. Wanatumia sehemu ndogo tofauti. Viunzilishi vinazingatiwa kama sehemu ndogo ya kawaida kwa mbinu zote mbili za PCR na Kufuatana. Vipimo vya awali vya PCR hutumika kwa ukuzaji wa mfuatano fulani wa DNA ilhali vianzilishi vya kupanga vinatumika katika muktadha wa kupanga kipande cha DNA kwa nia ya kufichua mpangilio wake mahususi wa mfuatano wa nyukleotidi. Hii ndiyo tofauti kuu kati ya vianzio vya PCR na vianzio vya mpangilio.
Primeta za PCR ni nini?
Polymerase Chain Reaction (PCR) ni mbinu ya kijeni ambayo hutumiwa katika nyanja ya biolojia ya molekuli ili kukuza nakala moja au chache ya sehemu fulani ya DNA na kupata mamilioni mengi ya nakala zinazofanana. Katika mmenyuko wa PCR, vipengele tofauti hutumiwa ikiwa ni pamoja na primers. Primers ni nyuzi fupi za DNA zenye urefu wa nyukleotidi 18-25 na kuzifanya ziendane na mwanzo na eneo la mwisho la vipande vya DNA vya kukuzwa. Primers inaweza kuwa primer mbele na reverse primer. Vianzio hivi hufungamana na kipande cha DNA katika sehemu maalum ambapo hutengeneza polimerasi ya DNA kushikamana na kianzilishi maalum katika eneo na kuanzisha usanisi wa uzi mpya wa DNA.
Uteuzi wa vianzio ni kipengele muhimu cha mchakato wa PCR. Uchaguzi wa urefu wa primer ni muhimu. Urefu bora utakuwa nucleotides 18-25. Ikiwa urefu ni mfupi sana au mrefu sana, vianzio havitajifunga kwenye mfuatano wa DNA ili kukuzwa kwa usahihi. Viunzilishi ambavyo ni vifupi sana kwa urefu husababisha uwekaji viambajengo visivyo maalum katika maeneo tofauti ya mfuatano wa DNA.
Kielelezo 01: Kompyuta za PCR
Maudhui ya Guanine na Cytosine (GC) katika kitangulizi bora yanapaswa kuwa kati ya 40-60. Joto la kwanza la kupenyeza na halijoto ya kuyeyuka ni mambo muhimu wakati wa PCR. Halijoto ya kuyeyuka inapaswa kuhesabiwa kwa usahihi, na halijoto ya kuyeyuka kwa primer inapaswa kuwa 5 0C chini ya kiwango cha kuyeyuka. Kiwango cha kuyeyuka kinapaswa kuwa 60 °C na 75 °C. Halijoto ya juu sana au ya chini sana itasababisha kupungua kwa shughuli za DNA polymerase.
Vianzishaji vya Kufuatana ni nini?
Vitangulizi vya mpangilio hutumiwa katika muktadha wa kupanga kipande cha DNA kwa nia ya kufichua utambulisho wake mahususi. Ili kupata matokeo mazuri ya mpangilio, vitangulizi na violezo vya ubora wa juu ni muhimu. Kwa hivyo, wakati primers zinachaguliwa, zinapaswa kuwa za kipekee kwa eneo fulani ambalo tunataka kufuata. Pia inapaswa kuwa na uelekeo sahihi ambapo mfuatano kawaida hutolewa kutoka ncha 3' hadi 5' za vianzio. Mlolongo unapaswa kukosa mseto usiohitajika kama vile uundaji wa loops za hairpin. Haipaswi kuwa na uundaji mfululizo wa besi za Guanine.
Kiwango cha kuyeyuka (Tm) cha kitangulizi lazima kifanane na masharti ya mfuatano. Kwa hivyo, inapaswa kuwa kati ya 52oC na 74oC. Maandalizi ya oligonucleotides kutumika kama primer inapaswa kusafishwa ili kupata urefu kamili unaohitajika wa mlolongo. Ikiwa oligonucleotidi zina uchafu, uashiriaji wa mfuatano wa kitangulizi utawekwa juu zaidi kutoka kwa tovuti tofauti za uanzishaji, na pia itapunguza idadi ya seli msingi.
Kielelezo 02: Kufuatana kwa Vianzilishi
Kiwango cha joto cha kuyeyuka (Tm) cha oligonucleotidi huamua, jinsi nyuzi za DNA zinazosaidiana zinavyochanganywa. Tm inaweza kuzingatiwa kama hesabu ya thermodynamic ambapo inategemea mfuatano wa DNA na hali kadhaa kama vile ukolezi wa chumvi. Tm ni muhimu wakati wa PCR ambapo lahaja iitwayo mpangilio wa mzunguko hutumiwa kutoa kikundi cha vipande vilivyokomeshwa vya dieoxynucleotide. Hapa, utangulizi ambao umepangwa hapo awali utaondolewa kwa njia mbadala, kisha kupanuliwa na mwishowe kutolewa kwa ukuzaji. Kwa hivyo, thamani ya Tm inapaswa kuwa kati ya 52oC na 74o C. Oligonucleotidi zilizounganishwa zinaweza kupatikana kutoka kwa maabara za usanisi za DNA/RNA kulingana na chaguo. Kiwango kidogo cha usanisi ambacho hutumiwa kwa mpangilio wa DNA kawaida ni 50 nmol. Pia muhimu zaidi viambishi vinavyotumika kupanga mpangilio vinapaswa kusafishwa ili visiwe na uchafu utakaozuia kupunguzwa kwa ubora.
Je, Kuna Ufanano Gani Kati ya Vitangulizi vya PCR na Vianzilishi vya Kufuatana?
- Vitangulizi vya PCR na Vianzilishi vya Kufuatana ni vianzio ambavyo hutumika katika mchakato wa ukuzaji wa mfuatano wa DNA unaolengwa.
- Vitangulizi vya PCR na Vipimo vya Kufuatana vinaundwa na nyukleotidi.
- Vitangulizi vya PCR na Vitangulizi vya Kufuatana ni oligomeri fupi.
Kuna Tofauti gani Kati ya Viunzi vya PCR na Vianzilishi vya Kufuatana?
Vitangulizi vya PCR dhidi ya Vifunguo vya Kufuatana |
|
| Vitangulizi vya PCR ni nyuzi fupi za DNA zenye urefu wa mfuatano wa nyukleotidi wa 18-25 na kuzifanya ziendane na mahali pa kuanzia na mwisho wa vipande vya DNA vinavyopaswa kukuzwa. | Vitangulizi vya mpangilio ni oligoma fupi ambazo hutumika katika muktadha wa kupanga kipande cha DNA kwa nia ya kufichua utambulisho wake mahususi. |
| Kazi | |
| Vitangulizi vya PCR hutumika kwa ukuzaji wa mfuatano fulani wa DNA. | Vitangulizi vya mpangilio hutumika katika muktadha wa kupanga kipande cha DNA kwa nia ya kufichua utambulisho wake mahususi. |
| Idadi ya vitangulizi Inahitajika | |
| Vitangulizi viwili; kitangulizi kimoja cha mbele na kitangulizi kimoja cha nyuma hutumika kama vianzilishi vya PCR. | Inahitaji kitangulizi kimoja tu kama kitangulizi cha mpangilio. |
Muhtasari – Vifunguo vya PCR dhidi ya Vipimo vya Kufuatana
Vitangulizi vya mpangilio hutumiwa katika muktadha wa kupanga kipande cha DNA kwa nia ya kufichua utambulisho wake mahususi. Kitangulizi kimoja cha mpangilio kitatosha kuendesha mchakato. Ili kupata matokeo mazuri ya mpangilio, vianzio vya ubora wa juu na violezo ni muhimu. Kwa hivyo, wakati primers zinachaguliwa, zinapaswa kuwa za kipekee kwa eneo fulani ambalo tunataka kufuata. PCR Primers ni nyuzi fupi za DNA zenye urefu wa nyukleotidi 18-25 ambayo inaendana na mwanzo na eneo la mwisho la vipande vya DNA vinavyopaswa kukuzwa. Kompyuta za PCR zinaweza kuwa msingi wa mbele na utangulizi wa nyuma. Maudhui ya Guanine na Cytosine (GC) katika primer nzuri inapaswa kuwa kati ya 40-60. Joto la kwanza la kupenyeza na halijoto ya kuyeyuka ni vipengele muhimu wakati wa PCR. Hii ndio tofauti kati ya vianzio vya PCR na vianzio vya Kufuatana.
