Tofauti Muhimu – RT PCR dhidi ya QPCR
Polymerase Chain Reaction ni mbinu inayotumiwa kukuza eneo mahususi la DNA in vitro. Kwa sababu ya uvumbuzi wa mbinu hii na Kary Mullis mnamo 1983, wanasayansi wanaweza kutengeneza nakala elfu hadi mamilioni ya vipande maalum vya DNA kwa madhumuni ya utafiti. Hivi sasa imekuwa mbinu ya kawaida na inayofanywa mara kwa mara katika maabara ya kliniki na utafiti kwa anuwai ya matumizi. Kuna tofauti za mbinu za kitamaduni za PCR kama vile RT PCR, PCR iliyoorodheshwa, multiplex PCR, Q PCR, RT – QPCR, n.k. RT PCR na Q PCR ni tofauti mbili muhimu za PCR. Tofauti kuu kati ya RT PCR na Q PCR ni kwamba RT PCR hutumiwa kugundua usemi wa jeni kupitia kuunda nakala za DNA (cDNA) kutoka kwa RNA huku Q PCR inatumiwa kupima kwa wingi bidhaa za PCR kwa wakati halisi kwa kutumia rangi za umeme.
RT PCR ni nini?
Reverse transcription polymerase chain reaction (RT PCR) ni kibadala cha PCR ambacho hutumika kutambua usemi wa RNA. Ni njia muhimu sana ya kugundua usemi wa mRNA kwenye tishu. RT PCR hutumika wakati nyenzo ya kuanzia ya sampuli ni RNA. Katika RT PCR, kiolezo cha mRNA hubadilishwa kwanza kuwa DNA ya ziada. Hatua hii huchochewa na kimeng'enya reverse transcriptase na mchakato huo unajulikana kama unukuzi wa kinyume. Pili, PCR ya kitamaduni hutumika kwa cDNA iliyosanisi mpya kwa ukuzaji.
RT PCR ni mbinu nyeti sana ambayo inahitaji kiasi kidogo cha sampuli ya RNA. RT PCR hutumiwa sana katika utambuzi na ukadiriaji wa spishi za RNA, haswa virusi vya RNA kama vile virusi vya upungufu wa kinga ya binadamu na virusi vya hepatitis C.
Kielelezo 01: Mbinu ya RT PCR
QPCR ni nini?
Quantitative PCR (QPCR) ni lahaja ya PCR ambayo hutumika kupima kwa wingi bidhaa za PCR. Pia inajulikana kama mmenyuko wa mnyororo wa polimerasi wa wakati halisi kwani hupima ukuzaji wa muda halisi kwa kutumia mashine ya muda halisi ya PCR. Ni njia inayofaa ya kubainisha kiasi cha mfuatano lengwa au jeni iliyopo kwenye sampuli. Kipengele cha kuvutia cha QPCR ni kwamba inachanganya ukuzaji na ukadiriaji wa kweli kuwa hatua moja. Kwa hiyo, haja ya electrophoresis ya gel katika kugundua inaweza kuondolewa kwa mbinu ya QPCR. QPCR hutumia rangi za fluorescent kuweka lebo kwenye bidhaa za PCR wakati wa miitikio ya PCR ambayo hatimaye husababisha ukadiriaji wa moja kwa moja. Bidhaa za PCR zinapojikusanya, mawimbi ya umeme pia hukusanywa na itapimwa kwa mashine ya muda halisi. QPCR inaweza kuunganishwa na RT PCR. Inajulikana kama RT - QPCR au QRT - PCR na inachukuliwa kuwa njia yenye nguvu zaidi, nyeti na ya kiasi ya kugundua viwango vya RNA katika seli au tishu.
SYBR Green na Taqman ni njia mbili zinazotumika kugundua au kutazama mchakato wa ukuzaji wa PCR ya wakati halisi. Mbinu ya SYBR ya Kijani hutekelezwa kwa kutumia rangi ya umeme inayoitwa SYBR kijani na hutambua ukuzaji kwa kuifunga rangi hiyo ili kutoa DNA yenye mistari miwili. Taqman hufanywa kwa kutumia vichunguzi vilivyo na lebo mbili na hugundua ukuzaji kwa uharibifu wa uchunguzi na Taq polymerase na kutolewa kwa fluorophore kama inavyoonyeshwa kwenye mchoro 02. Mbinu zote mbili hufuatilia maendeleo ya mchakato wa ukuzaji na kuripoti wingi wa bidhaa kwa wakati halisi..
PCR ya wakati halisi ina aina mbalimbali za matumizi kama vile ukadiriaji wa usemi wa jeni, uchanganuzi wa RNA usio na msimbo, uchanganuzi wa SNP, ugunduzi wa lahaja za nambari za nakala, ugunduzi wa mabadiliko nadra, utambuzi wa viumbe vilivyobadilishwa vinasaba, utambuzi wa mawakala wa kuambukiza., nk
Kielelezo 02: Mbinu ya kiasi ya PCR
Kuna tofauti gani kati ya RT PCR na QPCR?
RT PCR dhidi ya QPCR |
|
| RT PCR ni mbinu inayotumiwa kutambua usemi wa jeni kwa ukuzaji. | QPCR ni mbinu inayokuza DNA na kubainisha bidhaa za PCR kwa wakati halisi. |
| Kuhusika kwa Enzyme ya Reverse Transcriptase | |
| Enzyme reverse transcriptase inatumika kwa RT PCR. | Enzyme reverse transcriptase haitumiki kwa QPCR. |
| Matumizi ya Molekuli Zenye Lebo za Fluorescent | |
| Dhai zenye lebo ya fluorescent au probe hazitumiki kwa RT PCR. | Dhai zenye lebo ya fluorescent au probe hutumika kwa QPCR. |
| Ukadiriaji wa bidhaa ya PCR | |
| Isipokuwa ikiunganishwa na QPCR, RT PCR haikadirii bidhaa ya PCR. | QPCR pima kwa kiasi bidhaa ya PCR. |
| Nyenzo za Kuanzia | |
| Nyenzo za kuanzia ni mRNA. | Nyenzo za kuanzia ni DNA. |
| Muundo wa cDNA | |
| DNA ya Nyongeza inatolewa wakati wa RT PCR. | DNA ya Nyongeza haitolewi wakati wa QPCR. |
Muhtasari – RT PCR dhidi ya QPCR
RT PCR na QPCR ni matoleo mawili ya PCR ya kawaida. Mbinu ya RT PCR inatekelezwa kwa sampuli za mRNA na inaendeshwa na unukuzi wa kinyume na utengenezaji wa cDNA. QPCR hutumika kukadiria bidhaa za PCR katika muda halisi wa mizunguko ya joto ya PCR kwa kutumia rangi za fluorescent au vichunguzi vilivyo na lebo. Katika QPCR, kiasi cha bidhaa ya PCR huwakilishwa na mawimbi ya umeme yanayotolewa na sampuli. RT PCR ni maarufu kama mchakato wa ukuzaji ilhali QPCR hutumiwa kama mchakato wa kuhesabu. Hii ndiyo tofauti kati ya RT PCR na QPCR.
