Tofauti kuu kati ya viasili nasibu na oligo dT ni kwamba kianzilishi nasibu ni mchanganyiko wa mifuatano yote ya oligonucleotidi ya hexamer, wakati kiambishi cha oligo dT kina kipande cha safu moja cha deoxythymidines 12–18.
Unukuzi wa kinyume ni utaratibu ambao cDNA inaweza kuunganishwa kwa kutumia mRNA au aina yoyote ya RNA. Ili kuzalisha cDNA, kimeng'enya cha reverse transcriptase na vipengele vingine muhimu vinapaswa kutolewa, hasa kiolezo na vianzio. Primers ni mpangilio mfupi wa DNA iliyoundwa mahsusi kwa ukuzaji wa mifuatano lengwa. Vitangulizi nasibu na viasili vya oligo dT ni aina mbili za kawaida za viasili vinavyotumika katika unukuzi wa kinyume. Kwa hivyo, primer nasibu au oligo dT primer ni DNA fupi oligonucleotidi mfuatano zinazohitajika kwa reverse transcriptase kuanzisha reverse transcript. Kulingana na kiolezo cha RNA, kitangulizi kinachofaa kinaweza kuchaguliwa kati ya aina hizi mbili za kianzio.
Vipimo vya Kuanzisha Nasibu ni nini?
Kitangulizi nasibu ni mchanganyiko wa oligonucleotidi unaowakilisha mfuatano wote unaowezekana wa heksameri. Mfuatano wa kwanza wa primer nasibu ni 5′ – d (NNNNNN) –3′ N=G, A, T au C. Kwa hiyo, viasili nasibu vinaweza kutumika kwa ukuzaji wa DNA yenye ncha moja au RNA kwa DNA polymerase au reverse transcriptase, kwa mtiririko huo. Kando na hilo, mchanganyiko wa primer bila mpangilio una uwezo wa kukuza maeneo yote ya RNA ili kutoa cDNA. Kwa hivyo, hutoa urefu tofauti wa cDNA.
Kielelezo 01: Vitambulisho Nasibu
La muhimu zaidi, mchanganyiko wa primer nasibu hauonyeshi umaalum wa kiolezo. Haina uwezo wa kutofautisha mRNA na spishi zingine za RNA. Na, inahusiana na aina yoyote ya RNA kwenye sampuli. Hata hivyo, mchanganyiko wa primer nasibu unafaa kwa unukuzi wa kinyume wa RNA bila mikia ya aina nyingi(A), kama vile rRNA, tRNA, RNA zisizo na misimbo, RNA ndogo, prokaryotic mRNA n.k., RNA iliyoharibika, na RNA yenye miundo ya pili inayojulikana.
Oligo dT ni nini?
Oligo dT primer ni kipande cha 12 - 18 deoxythymine (dT). Mfuatano wa kianzilishi unaweza kuwakilishwa kama 5'-d (TTT TTT TTT TTT TTT TTT)-3. Inatumika kwa utengenezaji wa cDNA kutoka kwa mRNA iliyo na mkia wa poly(A). Kimsingi, hufanya kazi kama kianzilishi cha mwitikio unaochochewa na reverse transcriptase. Wakati wa unukuzi wa kinyume, oligo dT inachambua kwa kutumia mkia ulioangaziwa poli kupatikana kwenye 3′ mwisho wa mRNA nyingi za yukariyoti na kuanza mchakato.
Kielelezo 02: Unukuzi wa Nyuma Kwa Kutumia Oligo dT Primer
Tofauti na primer nasibu, oligo dT primer haifai kwa RNA iliyoharibika au RNA ambayo haina mikia ya poly(A), ikiwa ni pamoja na prokaryotic RNA na microRNA.
Je, Kuna Ufanano Gani Kati ya Random Primers na Oligo dT?
- Primeta nasibu na oligo dT primer ni aina mbili za viasili ambavyo hutumika katika unukuzi wa kinyume na kutengeneza cDNA.
- Kutumia primer nasibu na oligo dT primer kwa pamoja huongeza usikivu wa usanisi wa cDNA.
- Ni mfuatano wa nyukleotidi fupi zenye nyuzi moja.
Nini Tofauti Kati ya Random Primers na Oligo dT?
Kitangulizi nasibu ni mfuatano mfupi wa oligonucleotidi unaojumuisha mfuatano nasibu. Wakati huo huo, oligo dT primer ni strand fupi inayojumuisha 12 hadi 18 deoxythymidines. Kwa hivyo, hii ndio tofauti kuu kati ya primers nasibu na oligo dT. Mfuatano wa primer nasibu ni 5′ – d (NNNNNN) –3′ N=G, A, T au C. Ambapo, mfuatano wa oligo dT primer ni 5′-d (TTT TTT TTT TTT TTT TTT)-3′. Kwa hivyo, tunaweza kuzingatia hii kama tofauti nyingine kati ya viasili nasibu na oligo dT.
Aidha, viasili nasibu havionyeshi umaalum wa violezo, na vinaambatana na spishi yoyote ya RNA, huku viasili vya oligo dT vinaonyesha umahususi wa mikia ya poly(A) ya mRNA ya yukariyoti.
Taswira iliyo hapa chini ni muhtasari wa tofauti kati ya viasili nasibu na oligo dT.
Muhtasari – Random Primes dhidi ya Oligo dT
Primeta nasibu na primer ya oligo dT ni aina mbili za viasili vinavyotumika katika usanisi wa cDNA. Kitangulizi cha nasibu kina mchanganyiko wa oligonucleotidi, inayowakilisha mfuatano wote unaowezekana wa hexamer, wakati oligo dT primer ni mlolongo wa safu moja ya deoxythymidines 12 hadi 18. Kwa hivyo, hii ndio tofauti kuu kati ya primers nasibu na oligo dT. Kando na hilo, viasili vya oligo dT ni muhimu kwa unukuzi wa kinyume wa urefu kamili wa RNA yenye mkia wa aina nyingi(A), ilhali viasili nasibu ni muhimu kwa unukuzi wa kinyume wa spishi nyingi za RNA, ikijumuisha RNA iliyoharibika, RNA ambayo haina mikia ya poly(A) na RNA iliyo na RNA. miundo ya sekondari. Kwa hivyo, kitangulizi nasibu haionyeshi umaalum wa kiolezo ilhali kitangulizi cha oligo dT kinaonyesha umaalum kuelekea mRNA ya yukariyoti iliyo na mkia wa poly(A).
